載體構築二三事 C2無限制酶克隆（一）

在一般的載體構築實驗裡，這是我最喜愛的方法。因為不用像限制酶-接合酶法那樣一個一個傷腦筋地去找單一切位，然後再去翻箱倒櫃看實驗室有沒有那些限制酶存貨或為了某一個特殊的切位去買一個可能以後都用不到的限制酶。

而且還可辦到那——瀟灑不留任何限制酶切位的「無痕構築(scar-less construction)」。

這個方法只會用到兩種酵素：Phusion DNA polymerase與DpnI restriction enzyme。

只要在DNA片段的兩端，各加上一段能用來PCR整個載體的引子序列，就能以DNA片段作為一對「巨大引子」來合成出「含有DNA片段的載體」（文獻中稱為第二次PCR）。然後用DpnI將「沒有DNA片段的載體」切碎，再用這些碎片作為引子去合成出「含有DNA片段且有甲基化的載體」。

原本的文獻只寫到用DpnI切碎後就轉型到大腸桿菌了，但我發現再加上額外的PCR合成能減少挑到「沒有DNA片段的載體」的機率，猜測是因為增加了「甲基化的含有DNA片段的載體」之故。