關於PCR的那些事

一般PCR的主要用途有兩種：確認基因是否存在 和 把基因調出樣本。

前者可用於鑑定基因型，加上引子與實驗條件如果設計得夠好，還能直接鑑定品種，如新冠病毒的鑑定。

後者主要用於克隆基因，這在生技公司的基因合成服務再進一步降價之前，仍然是取得基因CP值最高的方法。

PCR的酵素是DNA聚合酶（DNA polymerase），其主要活性是在引子黏合到模版上後，將DNA從引子的3’端開始，依模版的DNA序列來進行互補的合成延長，這個活性稱為5’->3’ DNA polymerase activity，最有名的代表酵素如Taq DNA polymerase。然而這種活性有時合成出的序列不會完全互補於模版DNA，因而讓PCR產物與原模版DNA的序列不同，這樣就只能初步鑑定基因是否存在，而無法完美克隆該基因。

有些DNA聚合酶還具有3‘->5’ DNA exonuclease activity。當與前述的活性共同存在時，一個負責快速延長DNA，一個負責在DNA尾端檢查是否完全互補於DNA模版，如果沒互補，就會將其切除，再交由前者的活性重新延長。因為就像是校稿一樣，這種DNA聚合酶又被稱為Proofreading DNA polymerase，較有名的有KOD+ DNA polymerase與Phusion DNA polymerase。這樣的酵素就很適合克隆基因了。

設計引子最強的工具依然是Primer3這個軟體，因為他內建的設計門檻很高，只要是通過他計算出來的引子對，幾乎每次都能做出完美的PCR產物。

然而，現實是殘酷的，許多基因依照他的高門檻是不可能設計出引子對的，因此我們常常要自己在模版上慢慢地「拉」引子，看看哪些地方比較有機會PCR成功，雖然有時候我們根本沒有選擇的權利。

我一般設計PCR的引子對有幾個條件：

1.引子對的黏合中溫（俗稱Tm值）差距在3度以內。(2度以內更好)
2.引子的黏合中溫範圍約在58～63度之間。
3.引子自黏(Homodimer)最穩定的結構的delta G大於-13 kcal/mol且自黏結構的3’端最後一個核酸不與其他核酸黏合。(大於-9 kcal/mol更好)
4.引子對互黏(Heterodimer)最穩定的結構的delta G大於-13 kcal/mol且互黏結構的3’端最後一個核酸不與其他核酸黏合。(大於-9 kcal/mol更好)
5.視需要，額外在引子的5’端加上延長的限制酶酵素切位與酵素穩定序列，或是核糖體結合位，或是Fusion PCR用的同源序列不等。

每一次要做一個新的PCR實驗時，都「必須」要用不同濃度的鎂、DMSO來配製PCR反應溶液。
一些設想比較周到的公司，就會額外附一小管鎂溶液與DMSO給你。
測試時的配法我喜歡簡單又粗暴的，
例如在5管基本50μl的PCR反應溶液裡分別直接加

0 μl Mg, 0 μl DMSO
1 μl Mg, 0 μl DMSO
1 μl Mg, 1 μl DMSO
2 μl Mg, 0 μl DMSO
2 μl Mg, 1 μl DMSO

通常我也會同時測試不同的PCR buffer，像Phusion DNA polymerase就會附HF buffer與GC buffer，以測試不同基因PCR時需要的條件。

所以就會變成上述5組條件在兩種 buffer中都分別配製，共為10組50μl的PCR反應溶液。別看這好像很多有點浪費，沒PCR出來要重新來過的時間成本才更高！

在配製PCR反應溶液的時候，要在冰上配製，以降低在配製過程裡損耗的酵素活性。私心建議大家可以去找陶藝教室自己做個PCR rack來用，放冰上嘟嘟好

再來是溫度條件，基本上每種酵素的條件都有差異，請好好閱讀生技公司送來的說明書，如果沒有就要一份，或去網路上查。

這裡唯二需要你自己更動的是黏合溫度(anealing temperature )與聚合延長溫度的時間(time of elongation temperature)。

前者一般用Taq DNA polymerase的話是引子對裡Tm較低那個的Tm-5度（只算黏到模版的Tm值就好，額外的序列像限制酶切位等等的就不用去算了），少數像Phusion DNA polymerase的話是引子對裡Tm較低那個的Tm+3度（只算黏到模版的Tm值就好，額外的序列像限制酶切位等等的就不用去算了）。

後者要看你的基因長度，一般Taq DNA polymerase的話是1分鐘1kb、2分鐘2kb這樣以此類推，極限大概4kb左右吧。而強一點的Phusion DNA polymerase約20秒1kb，極限大概是7kb左右吧，更長的我沒試過。

行文至此有點累了啊⋯⋯

可能還有一些什麼我忘了提到

所以如果對PCR還有什麼問題，可以在底下留言討論

照片是我自己做的陶製PCR rack!