載體構築二三事 C2無限制酶克隆（二）

實驗流程與細節：

1.用RF-Cloning網站(https://www.rf-cloning.org)設計引子，並令用來合成出「含有DNA片段的載體」區域的Tm值大於攝氏59度。然後紀錄第二次PCR需要的延長時間。

2.在下訂單購買長於40碼的引子時，記得一定要買PAGE純化的，以減少錯誤率。

3.用Phusion DNA polymerase PCR合成出待克隆到載體的DNA片段，並同時測試以下的PCR條件（50μl Phusion reaction）：

[HF buffer]
[HF buffer+MgCl2(50 mM) 1.5 μl]
[HF buffer+MgCl2(50 mM) 1.5 μl+DMSO 1 μl]
[GC buffer]
[GC buffer+MgCl2(50 mM) 1.5 μl]
[GC buffer+MgCl2(50 mM) 1.5 μl+DMSO 1 μl]

4.跑電泳確認PCR產物是否成功合成出來了，並用膠體純化出合成出的PCR產物，即為「巨大引子」（我是用Thermo的GeneJET Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit，照說明書做就行了，如果純化完的DNA 濃度低於50ng/μl，就再重新PCR並膠體純化一次。另須注意不要開啟離心機的降溫功能，不然用column純化DNA是會失敗的。）

5.用任一品牌的Miniprep kits來萃取載體。

6.用DNA接合酶計算(https://reurl.cc/lgqG1j)的方式去算「巨大引子」與載體的莫爾數比例，令其為3:1，並使兩者的質量總和介於50ng到500ng之間，以增加環狀DNA構成的機會。

7.配製2nd PCR:

5x GC buffer 10 μl
MgCl2(50 mM) 1.5 μl
dNTP(2.5 mM) 4 μl
gel-purified 1st PCR product X μl (as calculation in Step 6)
plasmid 0.5或1μl
ddH2O 30 μl (對)
Phusion 0.25 μl

8.Run 2nd PCR procedure as:

98oC 98oC 59oC 72oC 72oC
30sec 10sec 2min time from Step1 5min
|____________x15____________|

9.After finished 2nd PCR, immediately add 0.33μl DpnI, mix and spin down.

10.The finial-touch cycle, run thermocycler as:

37oC 80oC 98oC 98oC 64oC 72oC
60min 20min 30sec 10sec 2min 5min

98oC 60oC 72oC 98oC 58oC 72oC
10sec 2min 5min 10sec 2min 5min

72oC 12oC
5min storage

（因為用這條件我每次都做得出來，所以我也沒試過其它的）

11.Transformation to high efficiency competent E. coli according to [Gene. 1990 Nov 30;96(1):23-8. doi: 10.1016/0378-1119(90)90336-p.]

12.瘋狂地用菌落PCR去找成功的載體吧！

原文的相關說明與文獻們：https://www.rf-cloning.org/QandA.php