載體構築二三事 A擬訂策略

1.依目的決定啟動子
a.純化蛋白質
我常用的純化方式是His-tag/Ni-NTA。
在蛋白質胜肽鏈之前或之後接上六個Histidine胺基酸，用來與Ni-NTA管柱裡的鎳結合，可簡單將大部分的雜蛋白質分離。通常不影響酵素活性，然複合次單元的蛋白質要考慮其結構特性，不能影響活性複合體的結合。
附帶一提，如果不純化也可額外加上His-tag作為Western-blot的目標抗原。
常用的誘導型啟動子有T7啟動子(需搭配DE3半乳糖誘導基因群）、araBAD啟動子（需搭配阿拉伯糖araC調控子，一般E. coli都有）、Lac4啟動子（真核用，酵母菌的半乳糖代謝基因啟動子）。
誘導方式是在菌株進入對數生長期不久（菌濃度約從0.05 OD600/ml長到0.5 OD600/ml時）加入誘導表現的物質；半乳糖啟動子可用半乳糖或IPTG(一種結構像半乳糖的物質，但無法被菌代謝分解），阿拉伯糖啟動子則要添加L-阿拉伯糖。

b.不純化蛋白質
通常是為了在菌體內額外加入生化反應，使其能產生較多我們想要的物質；如酒精、丁醇、氫氣、戊二胺、PQQ、蝦紅素不等。
然而，如果只是一眛地過量表現額外的酵素在菌體內，就有可能會破壞菌體原本的生理代謝，結果讓產量變低、菌生長得變慢或完全無法生長。
所以在做代謝工程的時候，一定要測試不同的啟動子，才有較高的機會達到目的。
我們可以用菌裡高度保留基因的啟動子，如持續表現型的glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase啟動子與alcohol dehydrogenase啟動子、對數期高表現的phosphoenolpyruvate carboxykinase啟動子、或來自噬菌體的持續高表現pR啟動子不等。
在原核生物裡的基因表現不用加上終止子（terminator)，但如果是要在真核生物表現基因的話，終止子是必要的。但這部分我著墨不多，一般都選用與啟動子相對的終止子來用。

2.選定構築方法
a.限制酶-接合酶法(Restriction-ligation method)
即使是請生技公司合成基因後選殖到載體上，他們依然最常使用這個方法。唯需要留意在基因之中不可有切接用的限制酶切位，因此有時候在克隆天然基因時，能夠選用的限制酶種類不多。在NEB網站上或一些生技軟體裡都可以讓你分析該基因的限制酶切位，只要避開那些就好。

b.無限制酶克隆(Restriction-free cloning)
我覺得這是在克隆天然基因的時候CP值最高的方法。只要用Phusion DNA polymerase與DpnI限制酶，再加上適當的引子設計就好。其概念是先用PCR放大出基因並在DNA兩端加上20～30mer的載體序列，再用這個基因當成引子去PCR放大載體，最後再用DpnI把原始載體切碎，留下用基因放大後的載體就完成了。由於是用PCR反應來克隆，因此只適用於沒有重複序列、小於8k bps且二級結構不複雜的基因。我試過一次組合三段基因，成功率雖不高，但可行。實驗流程可參考：https://www.facebook.com/104490008489541/posts/253230683615472/?app=fbl。

c.吉普森組裝(Gibson assembly)
以商用套件來說，這真的是最好用的克隆工具，但缺點就是貴。與無限制酶克隆的第一步相同，先用PCR放大出基因並在DNA兩端加上20～30mer的載體序列，再把載體用限制酶從要選殖的位置切開後，將兩者混合於含exonuclease、DNA polymerase與DNA ligase的反應液裡，50度反應1小時就成了。文獻說可一次組合15段基因，但我沒試過。

下一步，設計PCR用的引子！