Kluyveromyces marxianus 電穿孔法勝任細胞製備

取 50 μL 的 K. marxianus 酵母菌殖入 5 mL 的 YPD 中，於 30oC 震盪 200 rpm 培養 12~16 小時。測其1/100濃度之O.D.600值，計算植入菌液50 mL YPD後O.D.600為0.2之量，再植菌。

計算公式如下：
C1*V1=C2*V2
C1*V1=0.2*(50+V1)
C1*V1=10+0.2V1
C1*V1-0.2V1=10
(C1-0.2)V1=10
V1=10/(C1-0.2) [ml] (上面為公式推導，可直接用這個算；V1為需植入的體積、C1為5 ml YPD之O.D.600值)

於30oC、200 rpm條件下培養3到4小時後，至其O.D.600值達到約 0.8~1.4時收菌。
在無菌操作台內將菌液倒入 50mL 離心管中，離心 (3,000 g，3 min)，倒去上清液並將殘餘液體吸乾。

加入 5 mL 的 pretreating buffer，配製方法:
4650 μL 的 YPD (1% Yeast extract, 2% Peptone, 2% Glucose)
100 μL 的 1 M HEPES (2.383 g HEPES in 100 mM Tris-HCl (pH 8.0), total volume 10 ml)
250 μL 的 500 mM DTT (0.771 g DTT in 10 ml ddH2O)

上下搖動以懸浮菌體，於 30oC 震盪 100 rpm 培養 1小時，離心 (3,000 g，4oC，3 min)，倒去上清液後吸乾液體。

加入 250μL 的electroporating buffer，配製方法:
25 μL 的 100 mM Tris-HCl (pH 7.5)
50 μL 的 135 mM Sucrose (0.23 g in 5 ml ddH2O)
5 μL 的 50 mM LiAc (0.025 g in 5 ml ddH2O)
50 μL的50% glycerol
120 μL ddH2O至總體積 250μL

輕輕搖晃使菌液懸浮，將菌液以50 μL分裝至 1.5 mL 的微量離心管，即為電穿孔勝任細胞。可用衛生紙包裹(使溫度緩降，以減低因為急速降溫而死亡的菌數)後冰於-80oC保存。