高效率大腸桿菌勝任細胞製備

這是用來進行DNA熱休克轉型用的大腸桿菌勝任細胞(Competent Cell)製備方法，今天才發現原來我一直都沒有發過...

所需材料：
1. 大腸桿菌 (不限於DH5α或JM109)
2. Lysogeny broth (LB) agar培養盤
3. SOB或SOC或LB培養液
4. TB buffer (以下為400 ml配方內容):
裝dd水350 ml
加HEPES 10 mM (0.9532 g)、
CaCl2 15 mM (0.66588 g)、
KCl 250 mM (7.455 g)
用10 N KOH調整pH到6.7 (10 N KOH ~ 60 μl)
溶解MnCl2 4H2O 55 mM (4.3538 g)
補dd水直到體積成400 ml
用0.45 μm過濾膜過濾
保存於4oC
5. DMSO

製備步驟：
1. 用菌保或勝任細胞的大腸桿菌在LB培養盤上畫出單一菌落(培養於37度，隔夜會長出菌落)
2. 刮取多顆單一菌落，溶到SOB/SOC/LB培養液10 ml (此為培養體積，下面以V代稱)
3. 用37度以下溫度培養至濁度達O.D.600為0.6左右(約兩小時，儘量不要超過O.D.600為1.2，轉型效率會下降非常多)
4. 將培養完成的菌管置於冰上10分鐘(以下皆須保持菌體處於低溫狀態，並可不需於無菌操作台進行)
5. 離心2500 g、4度C、10分鐘，去上清液
6. 以冰的3.2 ml (0.32 * V) TB buffer回溶菌泥，置於冰上10分鐘
7. 離心2500 g、4度C、10分鐘，去上清液，此時菌泥應成”開口笑”形狀
8. 溫柔地以冰的0.8 ml (0.08 V) TB buffer與0.06 ml (0.006 V) DMSO回溶菌泥，置於冰上10分鐘
9. 以0.1 ml分裝到新的離心管，並立即丟入液態氮
10. 保存於-80度

參考論文：
Inoue H, Nojima H, Okayama H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 1990 Nov 30;96(1):23-8. doi: 10.1016/0378-1119(90)90336-p. PMID: 2265755.

下圖為離心後呈現"開口笑"的大腸桿菌菌泥