淺談COVID-19疫苗所應用的生物科技（2/2）

簡介COVID-19疫苗，製造出可傳送至體內的COVID-19情資時，所應用的生物技術

本篇簡述病毒載體疫苗（AZD1222，AZ）、mRNA疫苗（mRNA1273 ，莫德納）、次單位疫苗（MVC-COV1901，高端）、不活化疫苗（ CoronaVac 科興），所應用的生物技術。

以DNA為傳遞資訊的重組腺病毒疫苗: AZD1222 （AstraZeneca，AZ）

AZD1222所使用的腺病毒載體──AdChOx

其病毒載體源自黑猩猩腺病毒，屬於無包膜雙鏈 DNA (dsDNA) 病毒。所選用黑猩猩腺病毒修飾改裝成病毒載體，因為人類對其沒有預先存在的免疫性。藉此期望此病毒載體在體內初次資訊時，不會運送到半路來訊息都還沒送到細胞核內，就被經驗老道的免疫特攻隊們給撲滅了。且病毒載體不具有細胞內複製的功能，也不具有傳染他人的能力，如同卸除武裝色改裝為運送DNA的小貨車。

雖然理論上預期大部分的人沒有對AdChOx有預存的免疫反應，但還是有部分的人會對此病毒載體產生非預期性的不良免疫反應，如：過敏。

此重組病毒內和什麼資訊？

其病毒載體內部所載的DNA情報，為全長棘蛋白（NCBI Reference Sequence: YP_009724390.1）。此序列來自中國復旦大學張永振（Yong-Zhen Zhang）教授的團隊，所分享得新冠狀病毒基因資訊（GenBank: MN908947.3），並選用在此資訊中的棘蛋白資料（GenBank: QHD43416.1），載入病毒載體中為疫苗的主要情資，藉此情報運送至細胞核，達成讓細胞協製抗原的目的。

以上所述基因資訊，皆收入於美國國家生物技術資訊中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）中，提供大眾自行參閱及研究。

此重組病毒會不會將外來的DNA內嵌入自身細胞的DNA？

此類的腺病毒在目前已知的機制中，將運送的DNA嵌入宿主DNA的機率極低，其大部分運送入的DNA，會在細胞核內飄遊或掛在核內邊。也因為內嵌宿主DNA機率極低，所以在細胞以有絲分裂（mitosis）增加新細胞的過程時，外來的DNA參與複製的機率也很低，因此在分裂後的新的細胞中可能不會有外源DNA的存在；如此外來的DNA永久性存在體內細胞中的機會更低。且外來的DNA隨著時間越長，被細胞內的酵素清理掉的機率越高，數量也會隨之降低。以病毒載體來說，此改裝的腺病毒是一個相對安全的技術。

此重組病毒是怎樣製造出來的呢？

病毒本身就並沒有靠自己複製，產生新自我的能力，必須命令被感染的宿主細胞協助；再者被改造修飾後的黑猩猩腺病毒，自身並不具有命令細胞產生新病毒的能力。

所以是藉由重組的細菌人工染色體（Bacterial artificial chromosome，BAC），裝載著重組病毒及棘蛋白的基因資訊（此資訊型態為DNA模式）。載有重組病毒資訊的BAC，會藉由電穿孔（Electroporation）技術，以電壓將細胞工廠的膜鬆動，藉此產生小孔，將BAC直接送入體外培養的細胞工廠──T-Rex HEK293（被改造過人胚腎293細胞，且可以協助產生高量蛋白質得細胞株）。並且藉此外送入細胞工廠核內的DNA，大量製造出重組病毒。

重組病毒內載的棘蛋白資訊，在細胞工廠製造重組病毒時，被抑制表達且不生產之。因此細胞工廠表面，理論上出現棘蛋白的機率很低。

腺病毒載體應用需要注意的項目

1. 畢竟外裝為病毒載體，需要特別注意免疫系統的反應。
2. 病毒在體內的壽命，也會影響產品的功效。
3. 考量病毒載體是否可以有效率包裝情資。
4. 是否在純化重組病毒時，可以去除大部分在培樣或在離心時的非必要物（如：細胞培養液、細胞碎片、離心時所添加的藥劑等）。

延伸閱讀
病毒載體與COVID-19的相關研究｜Viral vectors for covid-19 vaccine development

AZD1222開發時期相關的發表｜
ChAdOx1 nCoV-19 vaccine prevents SARS-CoV-2 pneumonia in rhesus macaques
A bacterial artificial chromosome (BAC)-vectored noninfectious replicon of SARS-CoV-2

以微脂體（liposome）包覆的mRNA疫苗: mRNA1273 (莫德納；Moderna)

mRNA1273的微脂體（liposome）簡介

微脂體的源發概念為──可與細胞膜親融的載體，所以微脂體成分大多與細胞膜組成所相似，磷脂質為主、膽固醇為輔。其中磷脂質為載體的主要架構，藉由疏水端、親水端及是否帶電荷的特性，合成團體、調節膜電位、包覆或乘載運輸物；膽固醇則是穩定此流動性架構的固定支架。

我們再進一步了解mRNA1273。mRNA1273粒徑分布範圍在80～100 nm；所組成比例──陽性磷脂質（SM-102）：中性磷脂質（Distearoylphosphatidylcholine，DSPC）：膽固醇（Cholesterol）：DMG-PEG 2000為50：38.5：10：1.5。其中的中性及陽性脂質比例，可調整微脂體的膜電位，所以照此比例合成的微脂體膜電位為正。而細胞膜的膜電位大多偏負，因此膜電位帶正的微脂體與細胞膜有很好的親融性；不只如此，膜電位偏正特性，也有利微脂體在微酸性環境中，包覆偏負電的mRNA。

還有值得一提，處微脂體外層飄動的PEG，像似微脂體的千絲萬手。可別小看他！PEG藉由富有彈性、柔軟，且不容易被捉到的特性，協助微脂體躲避免疫游擊隊捆棒式的吞噬攻擊。提高微脂體將mRNA送入細胞中的機率！

為什麼mRNA疫苗需要包覆？

因為mRNA體外及體內的半衰期都非常短，且打入高量的mRNA在沒有做任何手段的包裝，可能馬上就會被免疫細胞或核糖核酸酶（RNAse）清掉。且因為mRNA的帶電性及親水性，不利其進入細胞中。因此運用與細胞膜相似的構造，包裹mRNA作為保護及運送的目的，最終期望細胞能轉譯該片段為抗原。

mRNA1273的mRNA序列載有什麼情資？

mRNA1273的mRNA序列資訊中，最主要傳遞的情資是──具有兩個突變位點的全長棘蛋白，分別是K986P及V987P；所以mRNA1273與AZD1222所提供的棘蛋白情資，會稍有不同。而在全長及蛋白上，所突變的K986P及V987P位點，可以讓細胞所製造的棘蛋白結構更加穩定。

蛋白突變位點的表示法，以K986P為例：986是胺基酸在序列的位子；K為原是胺基酸的縮寫，代表原始胺基酸為離胺酸（Lysine）；P則是突變後胺基酸的縮寫代表脯胺酸（Proline）。因此K986P可以解釋為，在胺基酸986的位子，已經由脯胺酸（Ｐ）代替原始的離胺酸（Ｋ）。

且此序列有特別的核糖核酸替代方式──Ｕ（尿苷，Uridine）全部被換成N1-甲基假尿苷（N1-methyl-pseudouridine）；藉此降低先天性免疫系統對此mRNA的攻擊，並提高mRNA被轉訊成胜肽（peptide）的效率。
此外，此條mRNA序列中的５端及３端，也包含讓mRNA序列穩定的非轉譯區（untranslated region，UTR），還有３端的多腺苷酸尾（3’ poly-adenylation tail，poly A tail），藉此讓序列更安定。
另外也在修飾序列時，配上了５端帽（5’Cap）。完成此修飾的mRNA結構，才會與飄揚在細胞質中，細胞所自製的成熟態mRNA相似。而５端帽在轉譯時，也扮演非常重要的腳色，因為與mRNA是否能成功招攬核糖體（mRNA轉訊成胜肽的工廠）前來，且願意降落協助進行轉譯有關。

這條mRNA與成熟型態的mRNA構造相似，理論上只會待在細胞質並不會入細胞核，也不須入核執行轉訓任務，其轉訓任務的地點位在細胞質。

mRNA1273是怎麼製造原理 

此mRNA是在體外合成，藉由T7 RNA 聚合酶（T7 RNA polymerase）的協助，將含有棘蛋白序列、５端及３端的非轉譯區序列，還有poly A tail的DNA模板轉錄成mRNA。之後mRNA會再經由封端酶（capping enzyme ）與牛痘2′ O－甲基轉移酶（Vaccinia 2′ O-methyltransferase）的協助，於mRNA的5端加帽，完成mRNA的修飾。

接著，mRNA們與脂質們會以1：2.5（mRNA：脂質）的比例，共處於微酸性環境（pH 5.0）。因處微酸環境，陽性脂質（SM-102）會以親水端帶正電荷的特性，吸引帶負電的mRNA；藉機包覆mRNA，並形成包覆mRNA的內層微脂體結構。之後合成物會再佐以其他輔劑，親水及疏水的特性，自行成團並組成微脂體。

微脂體做為載體時的應用注意事項

1. 如何讓微脂體躲避免疫細胞的辨識？
2. 微脂體的包覆率及乘載率，以及運輸物被包覆後是否可以呈穩定狀態？
3. 微脂體在包覆載物後，載體的安定性及在環境中的穩定性。
4. 製造過程的可否達到包覆載體後無菌，以及不殘留過多的有劑藥劑？
5. 是否能達到穩定製成，可以產出具有一致性的粒徑範圍，且膜電位正負偏差需小於30 mV的微脂體？

延伸閱讀
mRNA1273所應用的微脂體技術｜
Lipid nanocarriers for microRNA delivery
State-of-the-art design and rapid-mixing production techniques of lipid nanoparticles for nucleic acid delivery

微脂體避免刺激免疫細胞的相關研究｜
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mRNA1273應用修飾mRNA相關的技術｜
N(1)-methylpseudouridine-incorporated mRNA outperforms pseudouridine-incorporated mRNA by providing enhanced protein expression and reduced immunogenicity in mammalian cell lines and mice

微脂體避免刺激免疫細胞的技術｜
A novel amino lipid series for mRNA delivery: improved endosomal escape and sustained pharmacology and safety in non-human primates

mRNA1273所應用的棘蛋白相關資訊｜
Impact of mRNA chemistry and manufacturing process on innate immune activation
SARS-CoV-2 mRNA vaccine design enabled by prototype pathogen preparedness
Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation

以重組蛋白質表達COVID-19的棘蛋白片段，次單位疫苗──MVC-COV1901（高端及Dynavax）

此疫苗正在臨床試驗中，本篇僅分享其在製照過程中所應用的生物科技，無深入探討疫苗的功效及副作用。

此疫苗由高端（Medigen Vaccine Biologics Corporation，MVC）與Dynavax，以技術授權方式相互合作。

相關合作方案新聞稿詳見｜高端疫苗使用美國Dynavax新型佐劑之新冠肺炎(COVID-19)疫苗 獲台灣政府補助

次單位疫苗中所提供棘蛋白資訊為何？

與mRNA1273的棘蛋白資訊源一樣，具有K986P及V987P突變位點的全長棘蛋白（S-2P）。不過，次單位疫苗會直接提供棘蛋白的蛋白結構，不須經由細胞做轉訊的解密任務，將棘蛋白的情資送到免疫演習場上。

簡述MVC-COV1901的棘蛋白製造流程

1. 將含有S-2P的基因資訊，送至細胞工廠──ExpiCHO-S 細胞（改造後的中國倉鼠卵巢的上皮細胞）。
2. ExpiCHO-S 細胞做為細胞工廠的任務：協助大量製成棘蛋白的重組蛋白型態；產生蛋白質的型態，為：棘蛋白－切割位－純化用的標籤。細胞工廠在適當的組合此重組蛋白後，會將其運至細胞外。
3. 分離細胞並收取細胞培養液（內含有棘蛋白）。
4. 藉由純化蛋白管柱內的吊鉤，以勾出純化用的標籤，藉此將重組棘蛋白從細胞培養液中分離出來。
5. 再用酵素切割重組蛋白的切割位，釋放出棘蛋白。
6. 藉膜孔為0.22 uM 的濾膜，以過濾的方式將細菌，和較大的雜質分子篩出（因為其大小大於孔徑），分離出無菌的棘蛋白進行疫苗的配方作業。

體外生產蛋白質可能會遇到的困難點

1. 蛋白質的結構是否在體外有具有穩定性？
2. 蛋白質在體外安定的環境參數、最佳藥物佐劑為何？
3. 蛋白質是否會被運送至細胞外，且具有適洽的水溶性？蛋白質是否黏性過高，要進行結構上的優化？（以利後續的純化製成）
4. 在蛋白質純化過程，純化標籤、切割位、管柱，以及藥劑的組合，是否會干擾純化，或破壞蛋白質結構？（純化過程需要多次試驗最佳組合，來進行優化製成。）
5. 純化蛋白質時，是否會堵塞純化時的管柱？（需進行結構優化、純化優化的反覆試驗）
6. 蛋白質是否會在體外自主性的凝結成團？（不利純化外，會讓蛋白質失去原本的特性，可能還會讓蛋白質無應用價值。）

延伸閱讀
MVC-COV1901研發時期的相關發表｜CpG-adjuvanted stable prefusion SARS-CoV-2 spike protein protected hamsters from SARS-CoV-2 challenge

將COVID-19病毒株滅活的不活化疫苗: CoronaVac (科興；Sinovac Biotech )

CoronaVac選用何哪種COVID-19的病毒株，來生產疫苗 ？

CoronaVac的病毒來源分離自中國一名重症病患，其病毒株編號為 CZ02W-202002。

簡述CoronaVac的不活化病毒製造流程

1. 病毒株在三級實驗室中經由細胞工廠──綠猴腎細胞（vero cell）所製造。
2. 分離細胞並收取細胞培養液，細胞培養液中內有大量病毒。
3. 將病毒浸泡在β-丙內酯（β-propiolactone，BPL），且處於2-8°C 的環境，12-24小時，目的使病毒失活。
   （BPL具有高滅活病毒的效力，對於病毒表面抗原相對較低的抗原損傷的優勢。）
4. 再輔以甲醛失活病毒，於 2-8°C 環境，將病毒浸泡甲醛 4±0.5 小時，
5. 純化及濃縮病毒（使用 300kDa 膜）。
6. 使用苯佐酶（benzonase）── 一種核糖酶，進行酵素水解細胞的DNA以及病毒RNA，目的將其片段化。
7. 進行不活化病毒的回收，以及以0.22µm的濾膜進行最終過濾。

為什麼BPL、甲醛可以失活病毒珠？

• BPL失活病毒珠的原理
  BPL與DNA或RNA序列中的Ｇ（ guanine），會產生共價鍵結，藉此鍵結進而破壞DNA或RNA的結構，毀損DNA或RNA內載資訊的功能，而使得病毒DNA或RNA沒有傳遞資訊的作用。
• 甲醛失活病毒珠的原理
  甲醛與DNA序列中的Ａ（adenine）的胺基會產生共價鍵結，因此損壞病毒DNA的結構。再者，還會甲醛與蛋白質的胺基鍵結，干擾蛋白質型態，並使蛋白質變性，失去原始的功能。

生產不活化疫苗要格外注意的事項

1. 在純化重組病毒過程時，要去除大部分在培樣或在離心時的非必要物。
2. 品管！品管！品管！需要非常注重不活化病毒的驗證試驗，確保每批疫苗都沒有具有感染力的病毒。

延伸閱讀

科興疫苗的製造流程與其疫苗優缺點介紹｜
保護力 50% 的中國科興疫苗，值得打嗎？
Development of an inactivated vaccine candidate for SARS-CoV-2
Recommendation for an emergency use listing of covid-19 vaccine (vero cell), inactivated submitted by sinovac

失活病毒的相關原理統整｜Inactivated virus vaccines from chemistry to prophylaxis: merits, risks and challenges

以BPL 滅活COVID-19，研發COVID-19疫苗的相關研究｜Development of an inactivated vaccine candidate for SARS-CoV-2

高量的 BPL （高於 1:1000 濃度）的滅活COVID-19，會形成病毒聚集體，還有使得病毒失去表面的抗原的完整性｜ Inactivation of SARS-CoV-2 by β-propiolactone Causes Aggregation of Viral Particles and Loss of Antigenic Potential

延伸Ｑ＆Ａ

Ｑ：給予整顆不活化的病毒株做訓練免疫訓練，與僅提供棘蛋白單位參與免疫演習，有何差別？

Ａ：給予越精確的棘蛋白情報，體內的免疫部隊越能通過演練，迅速的培訓特工精兵。但並非沒有弊端。若突變病毒已經改變部分進攻策略，且情資已經與疫苗提供的資訊相左，這時候的疫苗功效會降低。
給予不活化的病毒株，雖然提供的情報資訊較雜，在訓練精兵方面相較之下會略為遜色。不過也是因為有提供病毒結構的其他相關訊息，所以在面對突變性疫苗，理論上具有較高的防守彈性度。但不代表不活化的疫苗一定能培訓出，面對突變病毒的免疫特效部隊。

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