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四維士乛工一口寸金真
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載體構築二三事 C1限制酶接合酶法(二)

四維士乛工一口寸金真
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Plan B 單限制酶切

如果實在是經費不足,或你的基因DNA序列就是那麼地容易被各種限制酶傷害,你只找得到一種真命限制酶來切接,那就得再額外求助於蝦蝦鹼性磷酸酶 (Shrimp Alkaline Phosphatase)來處理切好的質體了!
在把環狀的質體用限制酶切成線狀後,再加入蝦蝦鹼性磷酸酶,去除線狀質體DNA頭上的磷酸基團,如此一來,就能減少線狀質體DNA在接合反應時,不理會我們的基因,自顧自地倒接回去的機率了!
鹼性磷酸酶其實在細菌與大部分的生物裏都找得到,但是因為它們大部分都很穩定,想停止酵素反應挺麻煩的。所以我們用的是來自寒冷北極的甜蝦鹼性磷酸酶,只要一加熱,就能讓它變性失去活性。蝦蝦除了好吃,還能用在基因工程

1.基因PCR後,用PCR clean-up kit去除引子、酵素與PCR反應溶液。
2.用Nano-drop或DNA電泳比色來得知質體與基因的DNA濃度。
3.配製兩管限制酶反應溶液,分別用來切質體與基因。
4.用PCR機器控溫來達成限制酶反應發動條件。
5.於切完的「質體」管中,加入蝦蝦鹼性磷酸酶,用PCR機器控溫來達成鹼性磷酸酶反應發動條件。
6.用PCR clean-up kit去除切下的片段、酵素與反應溶液,如果須去除的片段大於100bps,則改用電泳膠體純化。

在用剪刀切完之後,我們要把剪刀移開,把碎片去掉才好操作下一步,對吧?

所以進行接合酶反應前,我們都得先用酒精沈澱DNA或用PCR clean-up kits或用膠體回收來去除切下的片段、酵素與反應溶液。
通常走完這一步的時候,你的DNA質量會變成原本的十分之一以下,或是更少,少到你會懷疑是不是還夠拿來做接合酶反應。
這個時候數學就很重要了,有個理論撐腰,我們會比較有信心!

至於算法,請參考 DNA接合反應計算 (https://reurl.cc/nr9eO6)

接合酶(T4 DNA ligase )
而接合酶反應原理就跟開頭說的一樣簡單,只要有ATP給它用,就能接起來了。可是一涉及到要在3度空間裡把一大堆有兩種長度的線頭尾相交,光是想像一下我都覺得麻煩了。
因此要完成這些接合反應的發動條件很奇妙,即使生技公司都說可以在室溫下放15分鐘就完成,但我也不是每次都成功,以下是依經驗來說,最推薦的幾種條件:
1.攝氏16度,6小時以上
最推薦,效率高,放在PCR機器裡明天再繼續做就好!

2.攝氏4度,12小時以上
如果遇到大於4k bps的基因片段,最好用這個方法,適合放個一整個週末!

3.室溫,15分鐘
酵素仿單上寫的方法,當你的基因片段在1k bps以內,這方法的確可以,但不知道為什麼,也不是每次都會成功。

附記:如果你的接合酶反應溶液是與酵素分開包裝的話,在貨到之後就要馬上分裝反應溶液成數個小管,每次使用就拿一小管出來退冰到室溫,混勻再使用,用完就丟掉吧!因為裏頭的ATP經不起反覆的凍融。反過來說,如果你的反應溶液已經反覆凍融了好幾回,那你可以幫它補個ATP,例如10X濃縮反應溶液的話,就補10mM的ATP進去,雖然會稀釋一點反應溶液,但這樣你的接合酶反應就會又好棒棒了喔!

CC BY-NC-ND 4.0 授权