載體構築二三事 C1限制酶接合酶法（二）

Plan B 單限制酶切

如果實在是經費不足，或你的基因DNA序列就是那麼地容易被各種限制酶傷害，你只找得到一種真命限制酶來切接，那就得再額外求助於蝦蝦鹼性磷酸酶 （Shrimp Alkaline Phosphatase）來處理切好的質體了！
在把環狀的質體用限制酶切成線狀後，再加入蝦蝦鹼性磷酸酶，去除線狀質體DNA頭上的磷酸基團，如此一來，就能減少線狀質體DNA在接合反應時，不理會我們的基因，自顧自地倒接回去的機率了！
鹼性磷酸酶其實在細菌與大部分的生物裏都找得到，但是因為它們大部分都很穩定，想停止酵素反應挺麻煩的。所以我們用的是來自寒冷北極的甜蝦鹼性磷酸酶，只要一加熱，就能讓它變性失去活性。蝦蝦除了好吃，還能用在基因工程

1.基因PCR後，用PCR clean-up kit去除引子、酵素與PCR反應溶液。
2.用Nano-drop或DNA電泳比色來得知質體與基因的DNA濃度。
3.配製兩管限制酶反應溶液，分別用來切質體與基因。
4.用PCR機器控溫來達成限制酶反應發動條件。
5.於切完的「質體」管中，加入蝦蝦鹼性磷酸酶，用PCR機器控溫來達成鹼性磷酸酶反應發動條件。
6.用PCR clean-up kit去除切下的片段、酵素與反應溶液，如果須去除的片段大於100bps，則改用電泳膠體純化。

在用剪刀切完之後，我們要把剪刀移開，把碎片去掉才好操作下一步，對吧？

所以進行接合酶反應前，我們都得先用酒精沈澱DNA或用PCR clean-up kits或用膠體回收來去除切下的片段、酵素與反應溶液。
通常走完這一步的時候，你的DNA質量會變成原本的十分之一以下，或是更少，少到你會懷疑是不是還夠拿來做接合酶反應。
這個時候數學就很重要了，有個理論撐腰，我們會比較有信心！

至於算法，請參考 DNA接合反應計算 (https://reurl.cc/nr9eO6)

接合酶（T4 DNA ligase ）
而接合酶反應原理就跟開頭說的一樣簡單，只要有ATP給它用，就能接起來了。可是一涉及到要在3度空間裡把一大堆有兩種長度的線頭尾相交，光是想像一下我都覺得麻煩了。
因此要完成這些接合反應的發動條件很奇妙，即使生技公司都說可以在室溫下放15分鐘就完成，但我也不是每次都成功，以下是依經驗來說，最推薦的幾種條件：
1.攝氏16度，6小時以上
最推薦，效率高，放在PCR機器裡明天再繼續做就好！

2.攝氏4度，12小時以上
如果遇到大於4k bps的基因片段，最好用這個方法，適合放個一整個週末！

3.室溫，15分鐘
酵素仿單上寫的方法，當你的基因片段在1k bps以內，這方法的確可以，但不知道為什麼，也不是每次都會成功。

附記：如果你的接合酶反應溶液是與酵素分開包裝的話，在貨到之後就要馬上分裝反應溶液成數個小管，每次使用就拿一小管出來退冰到室溫，混勻再使用，用完就丟掉吧！因為裏頭的ATP經不起反覆的凍融。反過來說，如果你的反應溶液已經反覆凍融了好幾回，那你可以幫它補個ATP，例如10X濃縮反應溶液的話，就補10mM的ATP進去，雖然會稀釋一點反應溶液，但這樣你的接合酶反應就會又好棒棒了喔！