載體構築二三事 C1限制酶接合酶法（一）

這個是經典到課本一定會提的DNA片段操作方法，其原理就像是剪刀（限制酶）與膠水（接合酶）一樣，只是限制酶通常只瞄準特定的DNA序列來切，所以只要我們的基因裡沒有它偏好的序列的話，就不用擔心會被錯剪了。而接合酶就真的是像膠水一樣，只要有DNA的頭（磷酸端）跟尾（羥基端）貼得很近，它就會把他們接起來！

設計限制酶反應注意事項：
1.甲基化阻礙（Methylation block）

生物會在自己的特定DNA序列上加上甲基，來防止被外來的限制酶切斷。
實驗室常用的大腸桿菌DH5alpha品系就有三種DNA甲基化酵素：Dam methylase、Dcm methylase與EcoKI methylase。分別會於GATC、CCWGG與AACNNNNNNGTGC或GCACNNNNNNGTT序列裡底線標記的位置上加上甲基。
有些常用限制酶如XbaI，它的切位序列是TCTAGA，如果不幸的這序列的左邊接著的是GA或右邊接著的是TC，那它的切割反應就會被阻礙，完全切不下去。
在選用限制酶前一定要先查明是否會被甲基化阻礙，不然會白做工的。
反之，也有那種只有甲基化後的序列才切得下去的限制酶，如常用來砍質體用的DpnI，它就專切GATC。

2.限制酶支點
你可以想像拿剪刀要剪紙的時候，越邊邊越難剪吧？限制酶也是一樣，當你把切位放在DNA的最邊邊的時候，它會很難切下去。所以我們要在限制酶切位的旁邊加上約5碼的一個小片段，讓它能抓穩一點。
這裡要加上的序列只要不會造成甲基化問題就好了，我的懶人序列是5碼A，AAAAA。以在XbaI切位上設計為例子，就是：AAAAATCTAGA。

下面我們來講操作方式吧！

以New England BioLabs(俗稱NEB)的限制酶來說，廠商送貨來的時候都會附上一張小卡，我稱之為「限制酶魔法卡」，因為當我們要發動限制酶反應的時候，只要照著卡片上的說明去做就好啦！
以DpnI為例，卡片正面標示著限制酶名稱與作用的DNA位置，還有保存條件等基本說明。卡片背面上標示著限制酶屬性，如果還想知道得更詳細可以去他們的網站查一下說明。然後是發動條件與在不同反應溶液下的威力變化，真是太好玩了，是不是？對不對？

1.雙限制酶切
現在的限制酶酵素系統很完整，在選擇雙限制酶切位的時候，你可以注意一下它們能不能共用反應溶液，可以的話就能夠同時讓它們一起反應切切。
反之，就得輪流來了，但我極不建議初學者這樣做，因為在操作DNA時，每一個步驟都會損耗DNA，最後修飾完成的DNA產物多寡會直接影響到克隆的成功率。以NEB的酵素來說，如果有標註CutSmart的話，就都能用同一種反應溶液。

a.一起切：在照限制酶魔法卡操作的時候，加入兩種限制酶讓它們去反應。
1基因PCR後，用PCR clean-up kit去除引子、酵素與PCR反應溶液。
2用Nano-drop或DNA電泳比色來得知質體與基因的DNA濃度。
3配製兩管限制酶反應溶液，分別用來切質體與基因。
4用PCR機器控溫來達成限制酶反應發動條件。
5用PCR clean-up kit去除切下的片段、酵素與反應溶液，如果須去除的片段大於100bps，則改用電泳膠體純化。

b.輪流切：在照限制酶魔法卡反應完一種後，用酒精沈澱DNA或用PCR clean-up kits去除反應溶液與酵素，再按照下一張限制酶魔法卡操作反應。
1基因PCR後，用PCR clean-up kit去除引子、酵素與PCR反應溶液。
2用Nano-drop或DNA電泳比色來得知質體與基因的DNA濃度。
3配製兩管限制酶反應溶液，分別用來切質體與基因。
4用PCR機器控溫來達成限制酶反應發動條件。
5用PCR clean-up kit去除切下的片段、酵素與反應溶液。
6配製兩管下一種限制酶反應溶液，分別用來切質體與基因。
7用PCR機器控溫來達成限制酶反應發動條件。
8用PCR clean-up kit去除切下的片段、酵素與反應溶液，如果須去除的片段大於100bps，則改用電泳膠體純化。

（待續）